乳酸细菌现代研究实验技术

前言

第一篇　乳酸细菌的分类鉴定

第一章　乳酸细菌的分类及有关属的特性

第一节　乳酸细菌的定义及其范围

一、乳酸细菌的定义

二、乳酸细菌范围的界定

三、乳酸细菌有关的属

第二节　乳酸细菌的分类位置

一、伯杰氏细菌分类系统

二、乳酸细菌分类近史

三、乳酸细菌在细菌系统中的位置

第三节　乳酸细菌有关属类群的划分

一、乳杆菌属及其有关属

二、肠球菌属及其有关属

三、双歧杆菌属及其有关属

四、芽孢杆菌和梭菌的有关属

五、近年报道的且尚未编入《伯杰氏系统细菌学手册》第二版的新属

第四节　乳杆菌属和有关属及其特性

一、乳杆菌属（Lactobacillus Beijerinck 1901）

二、类乳杆菌属（Paralactobacillus Leisner et al2000）

三、片球菌属（Pediococcus Claussen 1903）

四、气球菌属（Aerococcus Williams et al1953）

五、营养缺陷菌属（Abiotrophia Bouvet et al1989，Kawamura et al1995）

六、肉食杆菌属（Carnobacterium Collins et al1987）

七、碱杆菌属（Alkalibacterium Ntougius and Russell 2001）

八、德瑟兹氏菌属（Desemzia Stackebrandt et al1999）

九、棍状菌属（Isobaculum Collins et al2002）

十、海生乳杆菌属（Marinilactibacillus Ishikawa et al2003）

十一、毛发球菌属（Trichococcus Scheff et al1984，emendLiu et al2002）

十二、明串珠菌属（Leuconostoc van Tieghem 1878）

十三、酒球菌属（Oenococcus Dicks et al1995）

十四、魏斯氏菌属（Weissella Collins et al1994）

第五节　肠球菌属和有关属及其特性

一、肠球菌属（Enterococcus Schleifer et al1984）

二、蜜蜂球菌属（Melissococcus Bailey and Collins 1983）

三、四联球菌属（Tetragenococcus Collin et al1993）

四、漫游球菌属（Vagococcus Collins et al1990）

五、链球菌属（Streptococcus Rosenbach 1884）

六、乳球菌属（Lactococcus Schleifer et al1986）

七、乳卵形菌属（Lactovum Matthies et al2005）

第六节　双歧杆菌属和有关属及其特性

一、双歧杆菌属（Bifidobacterium OrlaJensen 1924）

二、斯氏菌属（Scardovia Crociani et al1996，Jian and dong 2002）

三、类斯氏菌属（Parascardovia Crociani et al1996，Jian and Dong 2002）

四、气斯氏菌属（Aeriscardovia Simpson et al2004）

五、异斯氏菌属（Alloscardovia Geert Huys et al2007）

六、另类斯氏菌属（Metascardovia Okamoto et al2007）

七、奇异菌属（Atopobium Collins and Wallbanks 1993）

八、欧鲁森氏菌属(Olsenella Dewhirst et al2001)

第七节　芽孢杆菌和梭菌有关的属

一、芽孢杆菌属 (Bacillus) 内属于乳酸细菌的种

二、嗜盐乳杆菌属（Halolactibacillus Lshikawa et al2005）

三、糖球菌属（Saccharococcus Nystrand 1984）

四、利斯特氏菌属 (Listeria Pirie 1940)

五、环丝菌属（Brochothrix Sneath and Jones 1976）

六、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus kitahara and Suzuki 1963）

七、孪生球菌属（Gemella Berger 1960）

八、毛形杆菌属（Lachnobacterium Whitford et al2001）

第八节　近年报道的乳酸细菌新属

一、矛形细菌属（Pilibacter Higashiguchi et al2006）

二、嗜果糖乳酸细菌属（Fructobacillus Akihito Endo et al2008）

三、夏普氏菌属（Sharpea Morita et al2008）

四、产乳酸细菌属（Lacticigenium Takao lino et al2009）

第二章　乳酸细菌的分离和培养

第一节　选择分离和培养方法的原则

一、乳酸细菌在自然界的生存区域和生活环境

二、必需的营养组分

三、对氧的要求

四、适宜的生长温度和pH范围

第二节　乳杆菌属的分离和培养

一、半选择性培养基

二、选择性培养基

三、不同生境乳杆菌分离的培养基

四、培养的气态环境和温度

第三节　肉食杆菌的分离和培养

一、半选择性DMRS培养基

二、甲酚红乙酸铊蔗糖（CTAS) 培养基

三、湖底肉食杆菌和水底肉食杆菌的分离和培养

四、永冻层肉食杆菌的分离和培养

第四节　明串珠菌的分离和培养

一、半选择性培养基

二、选择性培养基

第五节　酒球菌的分离和培养

一、酸性番茄培养基（ATB培养基）

二、果糖吐温80培养基 (FT 培养基)

三、葡萄汁培养液

第六节　芽孢乳杆菌的分离和培养

一、纳亚氏分离法

二、东韦氏分离法

三、芽孢乳杆菌的培养

第七节　肠球菌的分离和培养

一、TTC叠氮化钠培养基(g/L)

二、卡那霉素七叶灵培养基

三、Proteose蛋白胨甘油磷酸钠培养基——KF培养基(g/L)

第八节　链球菌的分离和培养

一、适用于链球菌样品转移的培养基

二、分离链球菌选择性的培养基

三、链球菌的培养

第九节　乳球菌的分离和培养

一、富集和分离

二、乳球菌的分离培养基

第十节　双歧杆菌的分离和培养

一、样品的收集和制备

二、双歧杆菌的分离培养技术

三、双歧杆菌培养基

第三章　乳酸细菌的分类鉴定方法

第一节　乳酸细菌的分类鉴定特征及其类别

第二节　生化特征测定方法

一、概述

二、氧化酶的测定

三、过氧化氢酶的测定

四、从葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气

五、碳水化合物发酵产酸实验

六、淀粉水解

七、石蕊牛奶

八、明胶液化实验

九、七叶灵水解

十、乙酰甲基甲醇实验 (VP实验)

十一、硫化氢的产生

十二、马尿酸盐的水解

十三、精氨酸产氨实验

十四、精氨酸水解实验

十五、葡聚糖的产生

十六、溶血反应实验

十七、脲酶的测定

十八、吡咯烷芳基酰胺酶(PYR)的测定

十九、果糖6磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)实验

二十、气相色谱测定乳酸及短链脂肪酸的分析法

第三节　乳酸细菌化学分类特征的测定分析方法

一、乳酸旋光度的化学测定法

二、醌的分析方法

三、细胞脂肪酸测定法

四、细菌细胞壁的组分及分析方法

第四节　基因型和系统发育型特征的实验方法

一、DNA的G+C含量测定

二、DNADNA 分子杂交方法

三、用PCRELISA反应的鉴定方法

四、用全基因组DNA脉冲场凝胶电泳的鉴定方法

五、16S rDNA序列同源性的鉴定方法

六、用基因组DNA扩增片段长度多态性的鉴定方法

七、16S rRNA序列分析方法和系统进化树的构建

第二篇　乳酸细菌发挥生理功能的物质基础

第四章　乳酸细菌细胞壁成分的分离和纯化

第一节　荚膜多糖的分离和纯化

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　脂磷壁酸的分离和纯化

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　肽聚糖的分离和纯化

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五章　乳酸细菌产生的糖类物质

第一节　产生胞外多糖的菌株和培养基

一、产胞外多糖乳酸细菌的分离、筛选

二、产胞外多糖的菌株和培养基

第二节　胞外多糖的测定方法

一、硫酸苯酚法测定多糖合成量

二、干燥称重法

三、高效液相色谱法（HPLC法）

四、硫酸蒽酮法

第三节　多糖的分离和纯化

一、概述

二、德氏乳杆菌保加利亚亚种胞外多糖的分离和纯化

三、嗜热链球菌胞外多糖的分离和纯化

四、复合糖的分离和纯化

第六章　乳酸细菌产生的抗菌物质

第一节　过氧化氢的定量分析

一、滴定法——高锰酸钾氧化法

二、分光光度法——辣根过氧化物酶法

第二节　细菌素的抑菌活性和效价测定方法

一、细菌素抑菌活性的测定方法

二、管碟法测定细菌素的效价

第三节　产细菌素乳酸细菌的筛选

一、细菌素产生菌的筛选

二、产乳链菌肽菌的筛选(一)

三、产乳链菌肽菌的筛选 (二)

第四节　细菌素的分离和纯化

一、吸附法初步纯化细菌素

二、植物乳杆菌KLDS 10391所产细菌素的分离和纯化

三、副干酪乳杆菌J23所产广谱抗菌肽BacJ23的分离纯化

四、嗜酸乳杆菌NX26所产抑菌物质的分离纯化

第五节　苯乳酸、4羟基苯乳酸和苯乙酸的定性定量分析

一、反相高效液相色谱法分析苯乳酸和4羟基苯乳酸

二、GCMS法分析苯乳酸和4羟基苯乳酸

三、苯乙酸的定性定量分析

第六节　3羟基丙醛（3HPA）产生菌的筛选和定性定量分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第七章　乳酸细菌产生的其他生理活性物质

第一节　γ氨基丁酸的定性定量分析

一、定性方法——平面色谱法

二、定量方法——HPLC

第二节　精氨酸脱亚胺酶的活性测定

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　血管紧张素转化酶抑制剂的检测

一、具有血管紧张素转化酶抑制活性的菌株的筛选

二、乳源降血压肽的制备工艺

三、血管紧张素转化酶抑制剂的定性定量分析

第四节　叶酸的定性定量分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五节　维生素B12的定性定量分析

一、定性鉴别

二、定量测定

第六节　胆汁盐水解酶的活性测定

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

第七节　透明质酸的定性定量分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第八节　共轭亚油酸的定性定量分析

一、共轭亚油酸高产乳酸细菌的筛选

二、共轭亚油酸的定性定量分析

第三篇　乳酸细菌在食品、保健品和动物饲料中的应用

第八章　乳酸细菌产生的风味物质

第一节　乙醛和双乙酰（丁二酮）的定性定量分析

一、乙醛和双乙酰的提取

二、乙醛和双乙酰的定量分析

第二节　支链氨基酸的分析

一、纸层析色斑洗脱比色法

二、高效液相色谱法

三、毛细管电泳

第九章　乳酸细菌发酵食品

第一节　乳酸细菌直投式发酵剂的制备

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　发酵酸奶的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　发酵乳清型多肽饮料的制备工艺

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　筛选发酵大豆食品的优良菌种

一、原理

二、材料

三、发酵参数

四、分析方法

第五节　发酵奶酪的实验

一、Cheddar干酪的制备工艺

二、Mozzarella干酪的制备工艺

第六节　人工发酵泡菜

一、原理

二、材料

三、方法与步骤

四、注意事项

第七节　发酵香肠的实验

一、原理

二、材料

三、方法与步骤

四、注意事项

第十章　乳酸细菌微生态制剂的制备

第一节　高密度培养

一、补料分批培养

二、细胞循环培养

第二节　粉末制剂的制备

一、真空冷冻干燥法

二、喷雾干燥法

第三节　益生菌片的制备

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　乳酸细菌微胶囊的制备

一、基于海藻酸钠的益生菌微胶囊的制备

二、空气悬浮法制备益生菌微胶囊

第十一章　动物用益生菌剂和青贮饲料发酵剂

第一节　动物用益生菌剂

一、芽孢杆菌益生菌剂

二、乳酸细菌益生菌剂

第二节　青贮饲料用的发酵剂

一、饲料作物及牧草上自然分布的乳酸细菌

二、青贮发酵实验法与乳酸细菌的分离

三、快速初筛选青贮饲料优良乳酸细菌

四、稻茎秸秆和未利用资源的乳酸细菌的开发与利用

五、青贮饲料发酵剂的制备

第四篇　乳酸细菌在疾病防治和保健中的应用

第十二章　乳酸细菌解毒和分解致癌物质

第一节　清除自由基活性的检测

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　降解生物胺的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　分解亚硝酸盐的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　降解黄曲霉毒素的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五节　降低重金属铅毒害的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

第六节　利用高效液相色谱法检测乳酸细菌脱基因毒性功能

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、数据处理

五、注意事项

第十三章　乳酸细菌耐酸、耐胆汁和抗胁迫反应

第一节　耐酸、耐胆盐乳酸细菌菌株的分离与筛选

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　乳酸细菌抗氧化活性的测定方法

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　抗高温胁迫的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　抗渗透压胁迫的实验

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第十四章　乳酸细菌的免疫功能与延缓衰老

第一节　宿主细胞的培养

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　宿主细胞的传代和保存

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　黏附实验

一、乳酸细菌细胞疏水性测定

二、乳酸细菌的黏附性测定

三、黏附性双歧杆菌菌株的筛选

四、不同细菌对细胞竞争性黏附

第四节　胞外多糖和脂磷壁酸的免疫调节　作用

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五节　乳酸细菌对Ｔ淋巴细胞亚群的影响

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第六节　乳酸细菌对血清抗体的影响

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第七节　乳酸细菌对黏膜抗体的影响

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第八节　利用秀丽隐杆线虫评价乳酸细菌延缓衰老的功能

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五篇　乳酸细菌在工业上的应用

第十五章　D乳酸和L乳酸的分析

第一节　L乳酸的检测

一、酶法测定L乳酸

二、高效液相色谱法测定L乳酸

第二节　D乳酸的检测

一、酶法测定D乳酸

二、HPLC法测定D乳酸

第十六章　乳酸细菌发酵生产乳酸工艺

第一节　以葡萄糖为原料生产L乳酸工艺

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　以纤维素为原料生产L乳酸工艺

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　以淀粉质为原料生产L乳酸工艺

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　以花生粕为原料生产D乳酸工艺

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第十七章　发酵产品中乳酸细菌的快速检测技术

第一节　发酵产品中乳酸细菌的快速计数方法

一、纸片法

二、电阻抗法

第二节　发酵产品中乳酸细菌的快速鉴定方法

一、实时荧光PCR法

二、变性高效液相色谱法

第十八章　产甘露醇和多糖水解酶菌的筛选

第一节　乳酸细菌发酵液中甘露醇的分析检测方法

一、薄层层析法分析发酵体系中的甘露醇

二、分光光度法分析发酵体系中的甘露醇

三、高效液相色谱法分析发酵体系中的甘露醇

第二节　产甘露醇乳酸细菌的筛选

一、产甘露醇乳酸细菌的初步筛选

二、产甘露醇乳酸细菌的复筛

第三节　多糖水解酶菌的筛选

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第十九章　乳酸细菌噬菌体的检测、分离纯化和防治

第一节　检测噬菌体的方法

一、原理

二、实验材料

三、实验方法

第二节　噬菌体的分离和纯化

一、原理

二、实验材料

三、实验步骤

第三节　噬菌体的防治

一、注重环境卫生

二、完善发酵工艺

三、生产菌株的轮番使用

四、噬菌体抗性菌株的选育

第六篇　乳酸细菌安全性评估方法

第二十章　乳酸细菌对抗菌药物的敏感性

笫一节　细菌耐药性表型检测

一、琼脂稀释法

二、KB纸片琼脂扩散法

三、Etest法

第二节　细菌耐药基因的检测

一、DNA探针法检测耐药基因（以β内酰胺酶基因为例）

二、PCR方法检测耐药基因（以检测红霉素耐药基因为例）

第二十一章　乳酸细菌有害酶及代谢产物的检测

第一节　硝基还原酶活性检测

一、定性检测

二、定量检测

第二节　偶氮还原酶活性检测

一、定性检测

二、定量检测

第三节　D乳酸含量检测

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　β葡萄糖苷酶活性检测

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五节　β葡萄糖醛酸苷酶活性检测

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第六节　生物胺含量检测

一、产生物胺能力的定性检测

二、产生生物胺能力的定量检测——丹酰衍生物的RPHPLC检测法

第二十二章　基于基因组学的乳酸细菌安全性评价

第一节　菌株的全基因组测序

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　基于全基因组的安全性相关信息分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第七篇　乳酸细菌的遗传与变异

第二十三章　乳酸细菌DNA的提取和纯化

第一节　染色DNA的分离和纯化

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第二节　乳酸乳球菌质粒DNA的提取

一、方法一

二、方法二

第三节　噬菌体DNA的提取

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　RNA与DNA共提取

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

目录第二十四章　乳酸细菌中基因导入和敲除的方法

第一节　乳酸细菌基因组洗牌重组

一、原理

二、材料和试剂

三、方法和步骤

四、技术优点

第二节　乳酸细菌感受态细胞的制备和电转化

一、乳酸乳球菌感受态细胞的制备和电转化

二、链球菌感受态细胞的制备和电转化

三、肠球菌感受态细胞的制备和电转化

四、乳杆菌感受态细胞的制备和转化

五、双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化

第三节　乳酸细菌的基因敲除

一、方法一

二、方法二

第二十五章　细菌素生物合成中功能基因的克隆及作用机制分析

第一节　乳链菌肽启动子的诱导表达

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

第二节　乳链菌肽抗性基因的筛选及鉴定

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　乳链菌肽抗性基因作用机制分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第四节　羊毛硫细菌素的半体外生物合成

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第五节　细菌素生物合成基因簇的克隆及功能分析

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

第六节　细菌素作用机制的分析——孔洞形成能力表征

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

四、注意事项

乳酸细菌现代研究实验技术第二十六章　乳酸细菌菌种的保藏和防止退化变异

第一节　细菌菌种退化和变异是普遍现象

一、引起菌种退化和变异的物质基础

二、引起退化和变异的原因

三、防止菌种退化和变异的措施

第二节　定期移植保藏法

一、原理

二、培养基

三、方法和步骤

四、注意事项

第三节　冷冻干燥法

一、原理

二、材料

三、方法和步骤

第四节　液氮超低温冻结保藏法

一、原理

二、材料

三、方法与步骤

第五节　超低温冻结法保藏

一、原理

二、材料

三、方法和步骤附录常用培养基组分

《乳酸细菌现代研究实验技术》是作者编著的有关乳酸细菌的多部专著之一。全书共介绍了近200个研究实验方法，既有坚实的理论基础，又有丰富的实验经验，内容新颖、全面、系统，能反映本领域国内外的最新研究成果和高新技术，为研究乳酸细菌的分类和鉴定提供了现代的和传统的技术；为探讨乳酸细菌的生理功能和安全问题提供了方法；为乳酸细菌在各个领域的应用提供了实验技能；为乳酸细菌改造提供了基因重组的手段。所以本书是乳酸细菌领域关于研究、开发、生产、使用的一本重要工具书。

《乳酸细菌现代研究实验技术》全面的介绍了乳酸细菌的分类和近200个研究实验方法，既有坚实的理论基础，又有丰富的实验经验，内容新颖、全面、系统，能反映本领域国内外的最新研究成果和高新技术，在国内外市场暂无同类书籍的情况下，是一本不可多得的优秀参考书。