噬菌体展示

第1章噬菌体生物学及噬菌体展示简介1

1.1简介1

1.2丝状噬菌体生物学1

1.2.1简介1

1.2.2噬菌体颗粒的结构2

1.2.3感染4

1.2.4复制5

1.2.5基因和基因表达5

1.2.6噬菌体装配生理学6

1.2.7噬菌体装配机制7

1.3噬菌体展示所使用的衣壳蛋白8

1.3.1pⅧ蛋白8

1.3.2pⅢ蛋白8

1.4着手一个噬菌体展示项目9

1.4.1展示的可行性9

1.4.2噬菌体载体还是噬菌粒载体？10

1.4.3多价展示还是单价展示？10

1.4.4辅助噬菌体12

1.4.5噬菌体制备及定量的一般实验方案12

1.5一个噬菌体展示项目的一般规则14

1.5.1一个文库的生成14

1.5.2筛选15

1.5.3克隆的分析15

1.6常见的问题16

1.6.1文库的质量16

1.6.2表达的编辑16

1.6.3过度筛选17

1.7作为替代的展示系统17

1.8噬菌体展示文库及试剂盒的商业来源17

参考文献18

第2章使用寡核苷酸定向诱变构建噬菌体展示文库21

2.1简介21

2.2文库设计的考虑21

2.2.1点突变21

2.2.2简并密码子的设计21

2.2.3理论的和实际的多样性22

2.3定点诱变22

2.3.1定点诱变与盒式诱变的比较22

2.3.2寡核苷酸定向诱变的化学和生物学23

2.3.3无活性模板的构建24

2.4文库的构建和保存24

2.4.1单链DNA模板的制备24

2.4.2异源双链CCC?dsDNA的体外合成26

2.4.3大肠杆菌的电转化和文库噬菌体的制备28

2.4.4文库的保存和再感染30

2.5生物试剂31

参考文献32

第3章体外DNA重组34

3.1导言34

3.2体外DNA重组的本底34

3.2.1体外DNA重组在定向进化中的使用34

3.2.2体外DNA重组的应用35

3.2.3重组统计学35

3.3体外DNA重组的方法35

3.3.1Stemmer法35

3.3.2来自大肠杆菌的内切核酸酶Ⅴ的DNA的随机片段化37

3.3.3随机引物重组38

3.3.4交错延伸程序38

3.3.5体外异源双链的形成和体内修复（异源双链重组）40

3.3.6重组方法的选择42

3.3.7本底的消除44

3.3.8技术要点45

参考文献46

第4章为提高蛋白及多肽的亲和性及特异性的噬菌体筛选策略47

4.1简介47

4.2载体的考虑48

4.2.1单价和多价噬菌体展示48

4.2.2确保展示的成功49

4.2.3通过噬菌粒载体的蛋白质表达49

4.2.4载体的构建及噬菌粒的制备50

4.3文库的设计51

4.3.1硬随机突变52

4.3.2软随机突变52

4.4靶标的呈递53

4.4.1直接固定53

4.4.2溶液中的结合54

4.4.3封闭54

4.4.4预筛选54

4.5筛选56

4.5.1结合缓冲液的考虑56

4.5.2选择压56

4.5.3竞争筛选57

4.5.4已结合的噬菌体的洗脱57

4.5.5扩增59

4.5.6筛选的监控59

4.6分析前的鉴定61

4.7DNA序列分析61

4.7.1测序的时机61

4.7.2序列的一致和同源62

4.7.3对一致性的评价62

4.7.4对噬菌体克隆的评价63

4.8疑难问题的排解63

参考文献64

第5章用噬菌体ELISA快速鉴定噬菌体展示蛋白的结合亲和性66

5.1简介66

5.2噬菌体结合性检测的主导参数66

5.3噬菌体结合性检测的进行68

5.3.1噬菌体样本的制备68

5.3.2加入的噬菌体和固定化靶标的滴定68

5.3.3与靶标结合的噬菌粒的测定70

5.3.4置换曲线的拟合71

5.4结语72

参考文献72

第6章使用重组肽库为受体识别新配体73

6.1简介73

6.2肽段展示系统简介73

6.3构建pⅧ噬菌粒随机肽库75

6.4筛选pⅧ噬菌粒库81

6.5鉴定所获取的克隆83

6.6先导肽的优化策略84

6.7用“冠状二聚体”系统构建次级库85

6.8冠状二聚体库的亲和筛选86

6.9转移到麦芽糖结合蛋白中分析87

6.10结论88

参考文献88

第7章底物噬菌体展示90

7.1简介90

7.2底物文库的构建91

7.2.1相互结合位点的选择92

7.2.2底物卡匣（cassette）的设计和构建92

7.3底物筛选程序93

7.4筛选出的序列的鉴定96

7.4.1初始的序列分析96

7.4.2“表达编辑”以及其他潜在的复杂化因素96

7.4.3底物的详细鉴定96

7.5方法的延伸以及未来的方向99

7.5.1底物消减文库100

7.5.2肽段连接酶的底物特异性100

7.5.3蛋白激酶的底物特异性100

7.5.4用反转录病毒展示载体（retroviraldisplayvector）进行的体内筛选100

7.6结论101

参考文献101

第8章从噬菌体展示文库中对稳定折叠的蛋白质及蛋白质结构域进行的基于蛋白酶的筛选102

8.1简介102

8.2方法概述102

8.3一般步骤及一个特例从一个具有疏水性核心的突变体文库中筛选稳定的泛素变异体104

8.3.1具有疏水性核心的突变体的噬菌粒文库的构建105

8.3.2噬菌粒文库的鉴定110

8.3.3稳定折叠的泛素变异体的蛋白酶筛选110

8.4噬菌体展示中基于蛋白酶的筛选的潜在新用途115

参考文献116

第9章锌指结构与其他核酸结合性基序的噬菌体展示117

9.1简介117

9.2构建一个展示DNA结合性蛋白质的噬菌体文库的初步构想117

9.2.1噬菌体展示技术合适吗？117

9.2.2了解蛋白质的DNA结合模式了吗？118

9.2.3应该随机突变蛋白质的哪一个结构域？118

9.2.4多价展示还是单价展示？119

9.2.5蛋白质骨架与筛选策略的选择119

9.3噬菌体文库卡匣的构建119

9.4噬菌体载体的制备及文库的构建122

9.5噬菌体的筛选124

9.6对筛选出的噬菌体克隆的分析126

致谢127

参考文献127

第10章噬菌体展示文库在体内及体外的筛选129

10.1简介129

10.2体内及体外的噬菌体展示129

10.3噬菌体载体130

10.4体内及体外噬菌体展示对照的比较130

10.5筛选过程130

10.6单个噬菌体的鉴定137

10.6.1插入的编码区域的PCR和测序138

10.6.2单克隆与器官或组织的脉管系统特异性结合的建立140

10.7结语145

致谢145

参考文献146

第11章利用血清筛选噬菌体文库147

11.1介绍147

11.2噬菌体文库的构建147

11.2.1随机肽文库147

11.2.2天然表位文库148

11.3结合血清抗体的噬菌体展示肽的选择153

11.4选择策略153

11.4.1序贯选择153

11.4.2平行选择153

11.5筛选单个克隆154

11.5.1免疫筛选154

11.5.2基于DNA的筛选156

11.6已选择克隆的鉴定159

11.6.1ELISA159

11.6.2通过亲和纯化鉴定结合特异性161

11.6.3交叉抑制实验161

11.6.4DNA测序164

11.7表位成熟165

致谢168

参考文献168

第12章使用展示在噬菌体上的cDNA文库进行相互作用克隆170

12.1概述170

12.2用于噬菌体cDNA文库展示的载体170

12.2.1丝状噬菌体170

12.2.2溶解性噬菌体（lyticbacteriophage）171

12.3在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库171

12.3.1pG6质粒简介171

12.3.2利用PCR从预制的λGT11文库中制备cDNA插入片段172

12.3.3连接与转化174

12.3.4gⅥ?cDNA文库的评价及保存177

12.4gⅥ?cDNA融合噬菌体亲和选择177

12.4.1噬菌体文库的获取和纯化177

12.4.2生物素化的诱饵的制备178

12.4.3用生物素化的诱饵的淘选过程178

12.4.4免疫亲和淘选过程179

12.5对选择出的克隆进行分析181

12.5.1噬菌体酶联免疫吸附反应182

12.5.2序列分析及所筛选的cDNA的全长克隆183

12.6应用183

致谢184

参考文献184

第13章噬菌体抗体文库186

13.1简介186

13.2噬菌体抗体文库构建186

13.2.1V区多样性的来源187

13.2.2天然V基因的来源194

13.2.3V基因文库的装配和克隆197

13.3制备用于抗原上选择的噬菌体抗体205

13.4从噬菌体文库中选择抗原特异性抗体208

13.5识别鉴定抗原结合性抗体212

13.6可溶性scFv片段的纯化218

13.7问题处理218

参考文献220

第14章噬菌体抗体的亲和力成熟222

14.1简介222

14.2在哪里又如何对抗体基因序列进行多样化222

14.2.1通过位点导向突变进行CDR3多样化构建scFv文库224

14.2.2构建用于亲和力成熟的链改组文库230

14.2.3构建轻链改组文库235

14.3选择和筛选亲和力更高的抗体237

14.4筛选解离速率优化的scFv240

参考文献241

　　如何计划一个成功的噬菌体展示和实验？噬菌体展示实验所需设备和试剂列表，实验步骤，构建噬菌体库，进行亲和筛选，分析所筛选克隆亲和性噬菌体展示常规常用。本书吸收了在该研究领域比较先进的实验室的大量经验，内容翔实，具有操作指导性强和参考价值高的特点。本书对噬菌体展示技术进行了较为充分的介绍和探讨，弥补了与噬菌体展示技术相关的发展领域资料的不足，其参考范围广泛，可为广大科研工作者提供更为便捷、快速的文献参考，提高该领域在国内的发展。本书适合于研究生和从事噬菌体展示的相关研究人员；从事生物技术和医药研究的基础研究者、临床研究者或药物筛选的研究者；以及相关领域的化学研究者等阅读参考。　　噬菌体展示技术已成为发展新特性多肽和改造已有多肽性质的强大工具。虽然此项技术已被广泛使用，但其仍然存在技术上的挑战，同时其新的应用和步骤也层出不穷。　　本书是一本与时俱进、通俗易懂且兼容并包的噬菌体实验设计和操作指南，对于那些在生物学研究和药物开发中使用该项技术的读者，具有很高的参考价值。　　本书的目的是为了使研究工作者能够设计和完成噬菌体课题中所涵盖的各方面工作从实验策略的设计、噬茵体库的构建到筛选的实施和结果的分析。本书提供了如下内容：　　.如何计划一个成功的噬菌体展示实验？　　.实验设备和试剂列表　　.实验步骤构建噬菌体库、进行亲和筛选、分析所筛选克隆亲和性　　.噬菌体展示常规应用包括从肽库中筛选配体、构建和使用噬菌体抗体库以及使用CDNA库展示进行表达克隆　　本书的一大特色：　　.在各章节中进行广泛的交叉引用使得读者能够跳出所介绍的具体实验步骤的限制，而对实验步骤加以改造，使之能为自己感兴趣的蛋白或筛选提供系统的服务。