濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究

第1章 药用石斛资源及其可持续利用现状

1.药用石斛应用及其资源现状

2.药用石斛资源再生现状

2.1 药用石斛的野生变家种

2.2 药用石斛的组织培养

3.药用石斛化学成分及药理作用

4.课题构想

第2章 霍山石斛类原球茎组织培养系的建立

1.实验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

2.实验方法

2.1 霍山石斛无菌苗的诱导

2.2 霍山石斛类原球茎的诱导

2.3 类原球茎增殖

2.4 霍山石斛类原球茎长期继代培养的品质稳定性考察

2.5 数据统计

3.实验结果

3.1 霍山石斛类原球茎的诱导

3.2 霍山石斛类原球茎的增殖

3.3 霍山石斛类原球茎的品质稳定性分析

4.讨论

第3章 霍山石斛多糖增强机体免疫功能的研究

1.实验材料

1.1 霍山石斛

1.2 实验动物

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2.实验方法

2.1 HPS的提取及含量测定

2.2 HPS的DEAE-Cellulose分级分离

2.3 RPMI-1640培养液配制方法

2.4 HBSS液的配制

2.5 脾细胞悬液的制备

2.6 腹腔巨噬细胞悬液的制备

2.7 HPS联合ConA诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ

2.8 HPS联合LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α

2.9 总RNA的提取

2.10 RT-PCR

2.11 统计分析

3.实验结果

3.1 霍山石斛HPS的提取和蛋白脱除

3.2 野生霍山石斛HPs对小鼠脾细胞产生IFN-γ的影响

3.3 野生霍山石斛HPs对小鼠脾细胞IFN-γmRNA表达的影响

3.4 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响

3.5 野生霍山石斛HPS对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达的影响

3.6 野生霍山石斛HPS不同组分的活性

3.7 野生霍山石斛多糖与类原球茎多糖组分及生物学活性比较

4.讨论

第4章 霍山石斛类原球茎液体培养碳氮代谢分析

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定

2.2 多糖提取和含量测定

2.3 可溶性糖含量的测定

2.4 蔗糖磷酸合成酶（SPS，EC2.4.1.14）、蔗糖合成酶（SuSy，EC2.4.1.13）和蔗糖酶（IT，EC3.2.1.26）活性的测定

2.5 可溶性离子NH、NO的含量测定

2.6 硝酸还原酶（NR，EC1.6.6.1）、谷氨酸合酶（GOGAT，EC1.4.1.14）和谷氨酰胺合成酶（GS，EC6.3 .1 .2）活性的测定

2.7 实验参数

3.实验结果

3.1 霍山石斛类原球茎的生长动态进程

3.2 pH的动态变化

3.3 胞内、胞外糖消耗的动态进程

3.4 碳源代谢关键酶活性的动态变化

3.5 胞内、胞外NH，和NOi消耗的动态进程

3.6 氮源代谢相关酶活性的动态变化

4.讨论

第5章 霍山石斛类原球茎生长和多糖合成调控

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 类原球茎悬浮培养与生长的测定

2.2 生长培养基优化方案设计

2.3 多糖合成调节方案设计

2.4 多糖提取与含量测定

2.5 可溶性糖含量的测定

2.6 霍山石斛多糖的DEAE-celltdose分级分离与含量测定

2.7 霍山石斛类原球茎多糖的生物学活性评价

2.8 实验参数

3.实验结果

3.1 类原球茎生长培养基的优化

3.2 HPS合成的调控

3.3 优化和调控条件下的HPS组分及生物活性评价

4.讨论

第6章 霍山石斛活性多糖的分离纯化及结构表征

1.实验材料

1.1 霍山石斛类原球茎

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2.实验方法

2.1 HPS的提取和DEAE-Cellulose分级分离

2.2 HPS-1的凝胶渗透色谱纯化

2.3 多糖组分活性测定

2.4 多糖的纯度及摩尔分子量测定

2.5 HPS-1823的比旋光度的测定

2.6 HPS-1823的扫描电镜观察

2.7 刚果红实验

2.8 紫外光谱分析

2.9 HPS-1823单糖组成成分分析

2.10 红外光谱分析

2.11 高碘酸氧化反应

2.12 Smith降解反应

2.13 多糖甲基化分析

2.14 多糖的部分酸水解分析

2.15 多糖的核磁共振波谱分析

3.实验结果

3.1 霍山石斛多糖的凝胶柱色谱分离纯化

3.2 类原球茎多糖HPS-1823纯度和分子量鉴定

3.3 类原球茎多糖HPS-1823比旋光度的测定

3.4 类原球茎多糖HPs-1B23的表观形态学观察

3.5 刚果红实验分析

3.6 类原球茎多糖HPS-1B23紫外光谱分析

3.7 类原球茎多糖HPS-1B23单糖组成成分分析

3.8 类原球茎多糖HPS-1823红外光谱分析

3.9 类原球茎多糖HPS-1823相邻单糖连接方式的分析

4.讨论

第7章 结论

《濒危名贵药用霍山石斛类原球茎液体培养生产活性多糖的研究》拟解决的关键难点在于霍山石斛类原球茎培养体系的建立、活性多糖合成的调节模式和活性多糖单组分的纯化与结构鉴定。研究中的创新点是突破试管苗快繁的常规方法，提出用类原球茎目的液体培养可持续开发药用石斛资源的新思路，克服了试管苗生根弱、移栽困难的限制。首次较系统地以霍山石斛为对象研究药用石斛类原球茎液体培养体系的建立方法与理论，为产业化开发提供理论支持，为其他药用石斛资源的可持续开发提供借鉴。研究的意义在于：①为霍山石斛类原球茎大规模培养直接生产药用成分提供理论依据和原始资料，这将是濒危珍稀霍山石斛药用资源再生及可持续利用的一条新途径；②为霍山石斛类原球茎直接替代野生霍山石斛使用的可能性提供可靠的实验依据；③多糖结构表征的结果将为探讨多糖构效关系和人工合成或改性多糖提供理论基础。