基因工程

1 概述

1.1 基因工程的基本概念

1.1.1 基因工程的基本定义

1.1.2 基因工程的基本过程

1.1.3 基因工程的基本原理

1.1.4 基因工程的基本体系

1.2 基因工程的发展历史

1.2.1 基因工程的诞生

1.2.2 基因工程的成熟

1.2.3 基因工程的腾飞

1.3 基因工程的研究意义

1.3.1 第四次工业大革命

1.3.2 第二次农业大革命

1.3.3 第四次医学大革命

2 DNA重组克隆单元操作

2.1 DNA重组的载体

2.1.1 质粒载体

2.1.2 九双链噬菌体DNA载体

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体

2.1.4 噬菌体/质粒杂合载体

2.1.5 人造染色体载体

2.2 DNA的体外重组（切与接）

2.2.1 限制性核酸内切酶

2.2.2 T4一DNA连接酶

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶

2.2.4 DNA切接反应的影响因素

2.2.5 DNA分子重组的方法

2.3 重组DNA分子的转化与扩增（转与增）

2.3.1 重组DNA转化的基本概论

2.3.2 受体细胞的选择

2.3.3 转化方法

2.3.4 转化率及其影响因素

2.3.5 转化细胞的扩增

2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检）

2.4.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定

2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定

2.4.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定

2.5 目的基因的克隆

2.5.1 鸟枪法

2.5.2 eDNA法

2.5.3 PCR扩增法

2.5.4 化学合成法

2.5.5 基因文库的构建

3 大肠杆菌基因工程

3.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理

3.1.1 启动子

3.1.2 终止子

3.1.3 SD序列

3.1.4 密码子

3.1.5 质粒拷贝数

3.2 大肠杆菌工程菌的构建策略

3.2.1 包含体型异源蛋白的表达

3.2.2 分泌型异源蛋白的表达

3.2.3 融合型异源蛋白的表达

3.2.4 寡聚型异源蛋白的表达

3.2.5 整合型异源蛋白的表达

3.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建

3.3 重组异源蛋白的体外复性活化

3.3.1 包含体的溶解与变性

3.3.2 异源蛋白的复性与重折叠

3.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制

3.4.1 细菌生长的动力学原理

3.4..2 发酵过程的最优化控制

3.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵

3.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

3.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制

3.5.2 改善工程菌不稳定性的对策

3.6 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

3.6.1 胰岛素的结构及其生物合成

3.6.2 人胰岛素的生产方法

3.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略

4 酵母基因工程

4.1 酵母的受体系统

4.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变型受体

4.1.2 抑制超糖基化作用的突变型受体

4.1.3 减少泛素依赖型蛋白质降解作用的突变型受体

4.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体

4.2 酵母的载体系统

4.2.1 酿酒酵母中的2μ环状质粒

4.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒

4.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒

4.2.4 含有4RS的YRp和YEp质粒及其构建

4.2.5 含有CEN的Ycp载体及其构建

4.2.6 含有TEL的YAC载体及其构建

4.3 酵母的转化系统

4.3.1 酵母的转化程序

4.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运

4.3.3 用于转化子筛选的标记基因

4.4 酵母的表达系统

4.4.1 酵母启动子的基本特征与选择

4.4.2 酵母启动子的可调控表达系统

4.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素

4.4.4 酵母表达系统的选择

4.5 酵母的蛋白质修饰分泌系统

4.5.1 酵母的蛋白质分泌运输机制

4.5.2 酵母的信号肽及其剪切系统

4.5.3 酵母分泌型蛋白的糖基化修饰

4.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗

4.6.1 乙肝病毒的结构

4.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建

4.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母的构建

4.7 利用重组醋自母生产人血清蛋白

5 高等动物基因工程

5.1 动物转基因技术的基本概念

5.1.1 动物转基因的效率

5.1.2 动物转基因的结构

5.1.3 动物转基因的表达特性

5.1.4 动物转基因的生物学效应

5.2 转基因导人动物体内的方法，

5.2.1 转基因的动物受体细胞系统

5.2.2 动物细胞物理转化法

5.2.3 动物病毒转染法

5.2.4 工程胚胎干细胞法

5.2.5 体细胞转基因克隆法

5.3 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能

5.3.1 利用转报告基因探测动物基因组中的调控序列

5.3.2 利用同源基因灭活细胞内源基因

5.3.3 利用cre/loxp系统条件性敲除基因

5.3.4 利用CRISPR/Cas系统条件性敲除基因

5.3.5 利用反义基因抑制细胞基因表达

5.3.6 利用干扰RNA阻断特定基因表达

5.4 利用转基因动物或细胞生产生物大分子

5.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理

5.4.2 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白

5.4.3 利用动物乳腺组织生产蛋白药物

5.5 转基因技术在动物遗传性状改良中的应用

5.5.1 转基因鼠

5.5.2 转基因兔、猪、羊

5.5.3 转基因牛

5.5.4 转基因鸡

5.5.5 转基因鱼

5.6 基因治疗

5.6.1 基因治疗的基本战略思想

5.6.2 肿瘤的基因治疗

5.6.3 囊性纤维变性症的基因治疗

5.6.4 杜兴肌营养不良症的基因治疗

5.6.5 重度联合免疫缺陷症的基因治疗

5.6.6 糖尿病的基因治疗战略

5.6.7 骨髓细胞的转基因研究

5.6.8 基因治疗的副反应及其对策

6 高等植物基因工程

6.1 高等植物的遗传学特性

6.2 高等植物的基因转移系统

6.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统

6.2.2 植物病毒介导的转染系统

6.2.3 植物细胞的直接转化方法

6.2.4 植物原生质体的再生

6.3 高等植物的基因表达系统，

6.3.1 外源基因的四环素诱导系统

6.3.2 外源基因的乙醇诱导系统

6.3.3 外源基因的类固醇诱导系统

6.3.4 外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统

6.4 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控

6.4.1 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱

6.4.2 利用病毒载体探查植物基因重排

6.4.3 利用转座元件克隆植物基因

6.4.4 利用T-DNA构建植物遗传突变株

6.5 利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料

6.5.1 利用植物生物反应器生产医用蛋白

6.5.2 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂

6.5.3 利用植物生物反应器生产工业原料

6.6 转基因技术在植物品种改良中的应用

6.6.1 控制果实成熟的转基因植物

6.6.2 抗虫害的转基因植物

6.6.3 抗病原体的转基因植物

6.6.4 抗除草剂的转基因植物

6.6.5 改变花型花色的转基因植物

6.6.6 抗环境压力的转基因植物

6.6.7 产生高品质产物的转基因植物

6.6.8 转基因植物的安全性

7 第二代基因工程——蛋白质工程

7.1 蛋白质工程的基本概念

7.1.1 蛋白质工程的基本特征

7.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用

7.1.3 蛋白质工程实施的必要条件

7.2 基因的体外定向突变，

7.2.1 局部随机掺入法

7.2.2 碱基定点转换法

7.2.3 部分片段合成法

7.2.4 引物定点引入法

7.2.5 PCR扩增突变法

7.3 基因的体外定向进化，

7.3.1 易错

7.3.2 DNA改组

7.3.3 体外随机引发重组

7.3.4 交错延伸

7.3.5 过渡模板随机嵌合生长

7.3.6 渐增切割杂合酶生成

7.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组

7.3.8 突变文库的筛选模型

7.4 蛋白质工程的设汁思想与应用

7.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性

7.4.2 减少重组多肽链的错误折叠

7.4 3改善酶的催化活性

7.4.4 消除酶的被抑制特性

7.4.5 修饰酶的催化特异性

7.4.6 强化配体与其受体的亲和性

7.4.7 降低异源蛋白药物的免疫原性

8 第三代基因工程——途径工程

8.1 途径工程的基本概念

8.1.1 途径工程的基本定义

8.1.2 途径工程的基本过程

8.1.3 途径工程的基本原理

8.2 途径工程的研究战略

8.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流

8.2.2 在现存途径中改变物质流的性质

8.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路

8.3 初级代谢的途径工程

8.3.1 乙醇生产菌的途径操作

8.3.2 辅酶Q生产菌的途径操作

8.3.3 氢气生产菌的途径操作

8.4 次级代谢的途径工程

8.4.1 聚酮生物合成的分子机制

8.4.2 聚酮合酶各组成模件的操作战略

8.4.3 聚酮生物合成基因的异源表达

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