基因操作技术

项目一 质粒pMD18 T EGFP的分离、纯化和鉴定

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 创建和谐包容性的工作环境

任务二 清洗、包扎常用玻璃器皿和耗材

任务三 配制并灭菌各种浓度单位的溶液

任务四 创建遗传信息流示意图

任务五 碱裂解法分离提取质粒pMD18 T EGFP及浓度测定

任务六 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pMD18 T EGFP

任务七 细菌基因组DNA提取及质量检测

四、项目思考

五、必备知识

（一）基因工程的发展简史

（二）基因工程实验规范

（三）溶液浓度的计算与换算

（四）生物学遗传信息流

（五）DNA的结构

（六）核酸的理化性质

（七）乳糖操纵元

（八）载体（一）

六、拓展知识

（一）基因组大小与基因数量

（二）基因操作对人类生存环境的影响

（三）真核生物DNA的提取

（四）真核基因组DNA的制备技术

项目二 绿色荧光蛋白基因（egfp）转录

产物RNA的提取

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 总RNA的提取及含量测定

任务二 mRNA的提取与纯化

任务三 RNA琼脂糖凝胶电泳

任务四 Northern blot

四、项目思考

五、必备知识

（一）RNA操作注意事项

（二）RNA的空间结构和功能

（三）mRNA的合成与加工

六、拓展知识

（一）植物病毒的RNA提取

（二）动植物组织mRNA提取

（三）兔肝RNA的制备

（四）人体细胞总RNA和mRNA的提取

项目三 体外扩增目的基因——绿色荧光蛋白基因（egfp）

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 以DNA为模板扩增绿色荧光蛋白基因（egfp）——PCR

任务二 以mRNA为模板反转录扩增绿色荧光蛋白基因——RT?PCR

任务三 实时荧光系统通过反转录定量（RT?qPCR）对基因表达进行分析

任务四 cDNA文库构建技术（一）——磁珠法提纯mRNA

任务五 cDNA文库构建技术（二）——cDNA链的反转合成

四、项目思考

五、必备知识

（一）DNA的生物合成

（二）RNA的生物合成

（三）DNA聚合酶的类别和性质

（四）其他工具酶

（五）PCR技术及其在基因克隆中的应用

（六）PCR产物的克隆

六、拓展知识

（一）巢式PCR

（二）cDNA文库构建技术

项目四 将绿色荧光蛋白基因（egfp）克隆到载体上

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 利用内切酶对载体和基因（egfp）进行酶切

任务二 酶切片段的脱磷技术

任务三 DNA片段的回收技术

任务四 基因的重组连接技术

任务五 cDNA文库构建技术（三）——cDNA的连接、包装及转染

任务六 RACE技术扩增构建全长cDNA文库

四、项目思考

五、必备知识

（一）限制性内切酶分类和催化机制

（二）DNA甲基化酶

（三）DNA连接酶

（四）其他工具酶的催化机制

（五）载体（二）

六、拓展知识

（一）分子标记

（二）RFLP技术

（三）RAPD技术

（四）AFLP技术

（五）SSR技术

项目五 将含有egfp基因的质粒转化到E.coli中

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 准备溶液及器皿

任务二 感受态细胞的制备及热激法将质粒转化到E.coli中

任务三 感受态细胞的制备及电击法将质粒转化到E.coli中

任务四 农杆菌转化植物细胞

任务五 磷酸钙转染动物细胞

四、项目思考

五、必备知识

（一）感受态细胞

（二）外源基因导入真核细胞的方法

（三）目的基因的筛选策略

六、拓展知识

（一）基因打靶技术

（二）从基因到基因组

项目六 基因（egfp）及基因产物（EGFP）检测

一、项目介绍

二、学习目标

三、项目实施

任务一 酶切重组载体鉴定目的基因

任务二 Southern blot

任务三 分子杂交

任务四 DNA测序鉴定目的基因一致性

任务五 ELISA检测表达产物

任务六 SDS?PAGE检测蛋白表达

任务七 Western杂交

任务八 等电聚焦电泳

任务九 蛋白产物的定量测定

四、项目思考

五、必备知识

（一）基因表达系统

（二）Southern blot

（三）分子杂交技术

（四）DNA测序

（五）报告基因的应用

（六）重组体的筛选与检测

六、拓展知识

（一）基因芯片

（二）基因治疗的基本原理和应用

前景

参考文献

《基因操作技术》为国家示范性高职院校一线教师和企业专家共同开发的教改成果教材。《基因操作技术》按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从核酸的提取→目的基因的制备→体外DNA的重组(酶切与连接)→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连。通过这些实验，学生可以熟练掌握分子生物学最基本的技术，并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。书中同时穿插了分子生物学其他必备的实验，以便培养学生比较全面的分子生物学实验技能。《基因操作技术》分为6个项目，每个项目由若干个任务组成，并且有“必备知识”作为任务的理论补充，“拓展知识”可以扩展学生的知识面，“项目思考”中设计的问题有助于培养学生独立思考能力和创新意识。　　《基因操作技术》可作为高职高专生物技术相关专业的教材，也可供相关技术人员参考。