微生物遗传学实验教程

目 录

总序

前言

第一章 微生物遗传学基本操作技术 1 实验一 CACl2法制备大肠杆菌感受态细胞及质粒转化 ·1 实验二 一步法制备和转化大肠杆菌感受态细胞 4 实验三 蜡状芽胞杆菌的电转化 9 实验四 聚乙二醇介导的链霉菌原生质体转化 ·12 实验五 丝状真菌土曲霉的原生质体制备及转化 18 实验六 产甲烷古菌脂质体转化 23 实验七 酿酒酵母高效转化：PEG/乙酸锂法 ·29 实验八 大肠杆菌-根瘤菌的接合转移 33 实验九 大肠杆菌-链霉菌的接合转移 38 实验十 细菌的局限性转导 43

第二章 微生物基因突变技术 49 实验十一细菌的紫外线诱变及营养缺陷型突变株的筛选与鉴定 ·49 实验十二 亚硝基胍诱变筛选抗生素过量表达突变株 ·57 实验十三 转座子引起的插入突变及盐敏感缺陷株的筛选62

第三章 微生物基因功能的研究 70 实验十四 基于宏基因组文库的功能基因筛选 ·70 实验十五 设计简并引物克隆目的基因·76 实验十六 根瘤菌的基因敲除及其功能鉴定 84 实验十七 融合 PCR技术在丝状真菌基因功能研究中的应用 91 实验十八 质粒置换法分析酵母的必需基因功能 ·100 实验十九 异源回补研究高等真核生物同源基因的功能 ·106 实验二十 定点突变技术确定目标蛋白的功能性氨基酸位点 113

第四章 微生物基因的表达与调控研究技术122 实验二十一 实时荧光定量 PCR法检测功能基因的表达差异 ·122

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实验二十二 利用报告基因检测链霉菌基因的表达 134 实验二十三 利用细菌单杂交系统研究转录因子与靶基因的互作 139 实验二十四 转录调控因子的凝胶阻滞分析 146 实验二十五 DNAse I足迹分析确定转录调控因子的 DNA结合序列 153 附录 1 157 附录 2 160 附录 3 162

《微生物遗传学实验教程》分为4 章，共25 个实验，涉及微生物遗传学基本操作技术；微生
物正向遗传学研究常用的方法；微生物基因功能研究技术；基因表达和调
控研究技术等4 个主要部分。实验操作对象既有革兰氏阴性菌、革兰氏阳
性菌（芽胞杆菌、放线菌），又有真菌（丝状真菌、酵母菌）和古菌。实验
技术包括了基因突变，化学、物理和生物因子对菌株进行随机诱变等遗传
育种方法，也有目的基因克隆、基因敲除、功能互补和目标蛋白功能性氨
基酸位点分析等技术。此外，还介绍了目前常用的基因表达与调控研究方
法，有基因表达分析、细菌单杂交、凝胶阻滞、Footprinting 寻找调控蛋白
与DNA 结合序列等方法。全书力求涵盖微生物遗传学研究常用的技术和
手段。