细胞生物学实验方案

1光学显微镜基础

1.1简介

1.2复式显微镜的关键部件

1.2.1镜体和镜灯

1.2.2聚光镜

1.2.3载物台和聚焦机制

1.2.4物镜

1.2.5目镜

1.3显微镜使用技术

1.3.1明视野显微镜术

实验方案1.1明视野显微镜的调节

实验方案1.2调定柯勒照明

1.3.2油镜的使用

实验方案1.3调焦步骤

1.3.3相差显微镜术

实验方案1.4相差显微镜的调节

1.3.4微分干涉对比显微镜术

1.3.5暗视野显微镜术

1.3.6荧光显微镜术

实验方案1.5调定落射荧光显微镜

1.3.7共聚焦显微镜术

1.3.8常见问题及显微镜保养和维修

1.4样本的准备和染色

1.4.1附着

实验方案1.6多聚L-赖氨酸包被

1.4.2固定

1.4.3准备组织切片

1.4.4染色

参考文献

2电子显微镜基础

2.1简介

2.2可用的电子显微镜方法

2.2.1负染色法

2.2.2玻璃化技术

2.2.3金属投影和冰冻断裂技术

2.2.4免疫标记

2.2.5专门技术

2.2.6设备与试剂的危险性

实验方案2.1聚乙烯醇缩甲醛-碳、连续碳和多孔碳支持膜的制备

实验方案2.2“微滴”负染色步骤(使用连续碳、聚乙烯醇缩甲醛-碳及多孔碳支持膜)

实验方案2.3免疫负染法

实验方案2.4负染色一碳膜技术：细胞及细胞器的分裂

实验方案2.5未染色及负染色的玻璃化样本制备

实验方案2.6生物样品的金属投影技术

实验方案2.7组织加工及树脂包埋的常规实验方案

实验方案2.8对细胞及细胞器悬液的琼脂糖胶囊化

实验方案2.9电镜超薄切片的常规染色

实验方案2.10包埋后薄切片的间接免疫标记

实验方案2.11使用免包埋电子显微镜技术显示核基质和细胞骨架

致谢

参考文献

3细胞培养

3.1细胞：分离和分析

3.2机械法分离组织

实验方案3.1机械剪切作用使组织解聚

实验方案3.2使用温热的胰蛋白酶使组织解聚

实验方案3.3冷胰蛋白酶消化

实验方案3.4应用胶原酶或中性蛋白酶解聚

3.3从体液中分离细胞

实验方案3.5从渗出液中回收细胞

3.4去除红细胞

实验方案3.6急速裂解法去除红细胞

实验方案3.7等密度离心法去除红细胞和死细胞

3.5细胞计数和细胞活力

实验方案3.8细胞计数和活力测定

3.6细胞培养的用途

实验方案3.9从单层培养物回收细胞

3.7冷藏

实验方案3.10冻存细胞

实验方案3.11解冻细胞

3.8外周血单核细胞的分离

3.8.1应用密度阻滞

3.8.2应用混合技术

3.8.3应用阻滞漂浮技术

实验方案3.12密度阻滞法纯化人外周血单核细胞

实验方案3.13混合剂技术纯化人外周血单核细胞

实验方案3.14阻滞浮选技术纯化人外周血单核细胞

参考文献

4细胞器的分离与功能分析

4.1简介

4.2匀浆化

4.3差速离心

4.3.1器材

4.4密度梯度离心

4.5细胞核及核组分

4.5.1细胞核

4.5.2核组分

4.6线粒体

4.6.1酶标记物

4.7溶酶体

4.7.1酶标记物

4.8过氧化物酶体

4.8.1酶标记物

4.9粗面与光面内质网

4.9.1酶和化学标记物

4.10高尔基膜

4.10.1酶标记物

4.11质膜

4.11.1用酶标记物分析质膜

4.12叶绿体

4.12.1叶绿体功能分析

实验方案4.1用碘克沙醇梯度溶液从哺乳动物肝脏中分离细胞核(并注意培养细胞)

实验方案4.2中期染色体的分离

实验方案4.3核膜的分离

实验方案4.4核孔复合物的分离

实验方案4.5核基质的制备

实验方案4.6核仁的制备

实验方案4.7用差速离心法从大鼠肝脏中分离重线粒体组分

实验方案4.8从组织和培养细胞中制备轻线粒体组分

实验方案4.9用Nycodenz不连续梯度溶液纯化酵母线粒体

实验方案4.10用中等载量Nycodenz不连续梯度溶液从哺乳动物肝脏或培养细胞中纯化线粒体

实验方案4.11琥珀酸-碘代硝基四唑盐紫还原酶检测

实验方案4.12不连续Nycodenz梯度溶液中溶酶体的分离

实验方案4.13β-半乳糖苷酶(分光光度测定)

实验方案4.14β-半乳糖苷酶(荧光测定)

实验方案4.15碘克沙醇梯度提取哺乳动物的过氧化物酶体

实验方案4.16过氧化氢酶检测

实验方案4.17碘克沙醇梯度溶液分析主要细胞器

实验方案4.18蔗糖梯度溶液分离光面及粗面内质网

实验方案4.19以自生成碘克沙醇梯度溶液分离光面与粗面内质网

实验方案4.20NADPH-细胞色素c还原酶检测

实验方案4.21葡萄糖-6-磷酸酶检测

实验方案4.22RNA分析

实验方案4.23从肝脏分离高尔基膜

实验方案4.24UDP半乳糖半乳糖基转移酶的检测

实验方案4.25人血影细胞的纯化

实验方案4.26大鼠肝脏中细胞膜的分离

实验方案4.275L核苷酸酶测定

实验方案4.28碱性磷酸二酯酶测定

实验方案4，29哇巴因敏感的Na+/K+-ATP酶测定

实验方案4.30绿叶或豌豆幼苗中叶绿体的分离

实验方案4.31叶绿体中叶绿素含量的测定

实验方案4.32叶绿体完整性的测定

参考文献

5在跨膜运输和细胞信号转导研究中使用的亚细胞膜的分级分离方法

5.1简介

5.2可采用的研究方法

5.3质膜区域

5.4参与内质网-高尔基体-质膜路径的膜区室的分析

5.4.1蔗糖-D20梯度

5.4.2浮力密度碘克沙醇梯度(预形成)

5.4.3沉降速度碘克沙醇梯度(预形成)

5.4.4用SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析

5.5从胞浆蛋白中分离膜囊泡

5.6内吞作用

5.6.1配体标记

5.6.2组织系统

5.6.3细胞系统

5.6.4分析

实验方案5.1利用蔗糖梯度从哺乳动物肝脏分离基底外侧和胆汁小管的质膜区域

实验方案5.2用抗体结合珠分离大鼠肝脏窦状区域

实验方案5.3用蔗糖梯度溶液从Caco-2分离顶端和基底外侧区域

实验方案5.4碘克沙醇梯度离心法从MDCK细胞中分离顶端和基底外侧区域

实验方案5.5脂筏的分离

实验方案5.6细胞膜小凹的分离

实验方案5.7利用不连续蔗糖-D20密度梯度分析细胞的高尔基体和内质网亚结构

实验方案5.8利用连续碘克沙醇密度梯度法分析细胞的高尔基体、内质网、内质网-高尔基体中间复合物和其他膜结构

实验方案5.9利用连续或非连续沉淀速率碘克沙醇密度梯度分析细胞的高尔基体、内质网、反式高尔基网络和其他膜结构

实验方案5.10细胞膜蛋白的SDS-PAGE

实验方案5.11半干印迹

实验方案5.12用增强化学发光法检测印迹蛋白

实验方案5.13从哺乳动物细胞和细菌中分离胞膜以及胞质组分

实验方案5.14分析在碘克沙醇组分中的早期和再循环的内吞体、转染的MDCK细胞中对转铁蛋白的内吞作用

实验方案5.15利用自生成的碘克沙醇梯度分析笼形蛋白包被囊泡的加工、大鼠肝脏无唾液酸糖蛋白的内吞作用

实验方案5.16多聚蔗糖-Nycodenz梯度用于分析哺乳动物肝脏中致密内体-溶酶体活动

参考文献

6体外实验技术

6.1简介

实验方案6.1使用人类无细胞系统的偶联DNA修复合成的核小体装配

实验方案6.2～实验方案6.4简介

实验方案6.2用卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物单标新生DNA

实验方案6.3用不同卤代脱氧胸腺嘧啶核苷类似物双标DNA

实验方案6.4同时对蛋白质和取代卤素-dU的DNA进行免疫染色

实验方案6.5暴露培养细胞内的核基质

实验方案6.6～实验方案6.7核基质与核纤层的相互作用简介

实验方案6.6核基质-核纤层蛋白相互作用：体外印迹覆盖分析

实验方案6.7核基质-核纤层蛋白相互作用：体外核重组装分析

实验方案6.8非洲爪蛙卵提取物的制备和免疫耗竭

实验方案6.9体外核组装和免疫荧光

实验方案6.10应用离体非洲爪蛙卵母细胞核检测核质之间的转运

实验方案6.11在核膜片的微阵列中用光学单转运体记录的方法检测转运

6.2细胞和膜系统

实验方案6.12链球菌溶血素O导致的细胞透化作用

实验方案6.13纳米胶囊：细胞内传送药物的新型载体

实验方案6.14酵母中抗氧化蛋白保护作用的检测方法的快速筛选

实验方案6.15神经细胞凋亡的体外检测

实验方案6.16～实验方案6.20线粒体膜通透性的转变简介

实验方案6.16线粒体膜通透性转变的测定：共聚焦激光成像法检测细胞或分离的线粒体中通透性转变与△ψm降低

实验方案6.17线粒体膜通透性转变的测定：用罗丹明123通过荧光计来检测通透性转变与△ψm的降低

实验方案6.18线粒体膜通透性转变的测定：用流式细胞仪检测细胞及分离的线粒体中通透性转变与△ψm的降低

实验方案6.19用蛋白印迹检测分离的线粒体中细胞色素c的释放

实验方案6.20将蛋白质输入分离的线粒体

实验方案6.21体外三元可溶性NsF附着蛋白受体复合物的生成

实验方案6.22肝脏内质网的体外重构

实验方案6.23糖脂不对称地掺入膜以及脂质跨膜运动的检测

实验方案6.24从大鼠脑组织纯化网格蛋白包被的囊泡

实验方案6.25在脂单层上重构内吞中间体

实验方案6.26高尔基膜管的形成

实验方案6.27紧密连接组合体

实验方案6.28重构主要捕光叶绿素a-捕光叶绿素b复合体到脂质体

实验方案6.29重构光系统2到脂质体

实验方案6.30体内及体外的高尔基体一波形蛋白相互作用

6.3细胞骨架和纤维系统

实验方案6.31微管过氧化物酶体相互作用

实验方案6.32免疫金免包埋电子显微镜法测定细胞基质蛋白

实验方案6.33紫杉醇和其他微管组装启动子诱导的微管组装

实验方案6.34波形蛋白的产生、纯化和组装及利用电子顺磁共振的研究

实验方案6.35神经丝装配

实验方案6.36微管蛋白诱导α-突触核蛋白形成

实验方案6.37体外合成β-淀粉样纤维

实验方案6.38体外可溶性Aβ1-42肽诱导的τ样过磷酸化

实验方案6.39反义肽

实验方案6.40β-淀粉样蛋白和酶的相互作用

实验方案6.41Ap的磷酸化

实验方案6.42体外smitin-肌球蛋白Ⅱ装配测定

实验方案6.43在EF-手型钙结合蛋白S100A4存在条件下，体外组装/拆卸肌球蛋白丝

实验方案6.44体外组装胶原纤维

7细胞和分子生物学参考数据

7.1化学品安全信息

7.2离心资料

7.2.1离心力的计算

7.2.2转子的应用

7.2.3沉淀时间的计算

7.2.4离心设备的保养

7.3放射性同位素数据

7.3.1核酸酶抑制剂

索引

近年来，细胞生物学领域取得了迅速的发展和进步。细胞生物学工作者对实验技术的需求日益增长，其中的许多技术也适用于分子生物学和分子遗传学。《细胞生物学实验方案》收录了许多很实用的细胞生物学实验方案，具体表现在：实验方案涵盖了光学显微术、电子显微术、细胞培养、细胞分离、细胞器的分离和功能分析、组织和膜分离以及体外实验技术；许多实验方案都提供了有用的“注释”和“安全措施”，便于操作；附录部分则收录了对于细胞生物学工作者来说非常有价值的生物学参考数据。　　

《细胞生物学实验方案》可供细胞生物学，分子生物学、基因组学，蛋白质组学等领域的研究生、高年级本科生及其他研究人员阅读参考。