流式细胞术基本原理与实用技术

第1章流式细胞仪基本结构与原理

1.1流式细胞仪基本结构与功能

1.1.1流式细胞仪基本结构

1.1.2流式细胞仪的基本功能与应用

1.2流式细胞术的重要术语

1.2.1前向散射与侧向散射

1.2.2Coulter效应与电子体积

1.2.3荧光信号及其面积与宽度

1.2.4光谱重叠与荧光补偿

1.2.5细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间

1.3流式细胞术基本原理

1.3.1流式细胞术分析的基本原理

1.3.2流式细胞术分选的基本原理

1.3.3流式细胞仪荧光补偿设置

1.4流式细胞术的样本设置

1.4.1常用对照

1.4.2一套完整的流式细胞术检测样本设置

1.5流式细胞术的数据分析

1.5.1数据显示与分析

1.5.2设门

1.5.3数据分析中几种常见图形及分析原则

第2章抗原抗体反应基本特点与流式抗体及荧光染料的选择

2.1抗原抗体反应基本特点

2.1.1抗原抗体结合具有特异性

2.1.2抗原与抗体的结合是可逆的化学反应

2.2抗原抗体反应影响因素

2.2.1电解质

2.2.2反应温度与时间

2.2.3pH值

2.3流式抗体的选择

2.3.1尽量使用直标抗体

2.3.2注意流式抗体的应用级别

2.3.3抗体滴度或标记量的选择

2.3.4根据流式细胞仪的类型及荧光素的荧光光谱选择荧光抗体

2.3.5根据检测物(抗原)表达量选择荧光染料

2.4荧光染料特性及其应用

2.4.1抗体标记荧光染料特性及其应用

2.4.2核酸荧光染料的特性及其应用

2.4.3细胞膜及其他荧光探针的特性及其应用

第3章细胞表面分子的检测与分析

3.1流式细胞术在细胞表面分子的检测与分析中的应用

3.1.1免疫细胞及其亚群的检测与功能分析

3.1.2血液系统细胞表面标志的研究

3.1.3细胞群体及细胞表面标志变化的监测

3.1.4细胞表面标志构成性质的分析

3.2标本制备

3.2.1血液或骨髓标本的制备

3.2.2体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备

3.2.3贴壁细胞的制备

3.2.4组织标本的制备

3.3细胞表面分子免疫标记方法

3.3.1直接免疫荧光法

3.3.2间接免疫荧光法

3.3.3全血直接标记法

3.3.4直接与间接免疫荧光混合染色法

3.4常用的免疫细胞表面标志的检测与分析

3.4.1T淋巴细胞及其亚类检测

3.4.2B淋巴细胞及其亚类检测

3.4.3NK细胞与NKT细胞检测

第4章细胞内或细胞核内抗原检测与分析

4.1流式细胞术分析细胞内或细胞核内抗原基本步骤

4.1.1细胞固定剂和穿膜剂的选择

4.1.2最佳抗体浓度的选择

4.1.3细胞膜内外FCR的封闭

4.2胞内抗原的检测与分析胞内细胞因子的检测与分析

4.3核内抗原的检测与分析调节性T细胞(Treg，CD4+CD25+Foxp3+)的检测与分析

第5章细胞凋亡的检测与分析

5.1样品来源与收集

5.2PI单染法亚“G1”峰检测法

5.3Annexin-V-PI复染法

5.4末端转移酶标记技术(TUNEL)

5.5细胞周期特异性细胞凋亡的检测(PI-Annexin-V，PA法)

第6章DNA含量检测与细胞周期的分析

6.1常用DNA和RNA染料

6.2DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义

6.2.1DNA倍体分析的判定标准

6.2.2DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义

6.3细胞DNA检测的内参考标准

6.3.1鸡红细胞

6.3.2人淋巴细胞

6.3.3鳖红细胞

6.4DNA样品的制备和检测

6.4.1DNA样品的制备和检测的影响因素与注意事项

6.4.2培养细胞或悬浮样品的DNA含量检测

6.4.3新鲜组织细胞核的DNA含量检测

6.4.4石蜡包埋组织块切片的DNA含量检测

6.4.5FCM在肿瘤脱落细胞学检查的应用

6.5数据采集后的软件分析

6.5.1运用ModFitLT进行自动分析

6.5.2运用ModFitLT进行手动分析

6.5.3运用ModFit进行同步化分析

6.5.4运用ModFitLT进行增殖分析

6.6药物对细胞周期的影响

6.7流式细胞核型分析

6.8FCM-DNA检测的质量控制

6.8.1标本采集和固定方法的质控

6.8.2单细胞悬液制备的质控制备

6.8.3石蜡包埋组织单细胞悬液制备的质控

6.8.4脱落细胞样品的采集

6.8.5细胞悬液荧光染色的质控

6.8.6流式细胞仪器操作技术质控

6.8.7流式细胞分析资料处理的质控

6.8.8定量荧光细胞染色技术的评价标准

第7章细胞增殖的检测与分析

7.1以检测细胞增殖抗原标志物为基础的分析法

7.1.1BrdU／DNA双参数法

7.1.2Ki-67检测与分析

7.1.3PCNA／DNA双参数法

7.1.4Cyclins／DNA双参数法

7.2以检测细胞分裂情况为基础的分析法

7.2.1检测细胞增殖的常用荧光染料及其分析原理

7.2.2以检测细胞分裂情况为基础的分析法的应用

第8章细胞毒的检测与分析

8.1体外细胞毒检测方法

8.1.1CFSE／PI或PKH-67／PI检测法

8.1.2GFP／PI检测法以NK杀伤活性为例

8.2体内CTL细胞毒检测方法CFSE标记法

第9章可溶性蛋白质分子的检测与分析

9.1可溶性蛋白质分子的定性、定量检测与分析

9.2可溶性蛋白质分子的定量检测与分析液相芯片技术(LabMAPTM和CBA技术)

9.2.1液相芯片技术的基本原理

9.2.2液相芯片的技术优势

9.2.3液相芯片的主要实验步骤

9.2.4LabMAPTM技术

9.2.5BD微球阵列分析技术(CBA技术)

第10章报告基因的检测和分析

10.1报告基因GFP及其突变体

10.2报告基因GFP及其突变体在生物学中的应用

10.2.1筛选新的药物

10.2.2发育分子机理研究

10.2.3细胞筛选或分选标记物

10.2.4基因产物功能及基因定位研究

10.2.5细胞功能活动的动态观察

10.2.6细胞、分子之间的相互作用研究

10.2.7体内示踪与应用

10.2.8在RNA干扰与核酶体研究中的应用

10.2.9免疫反应示踪标志物

10.2.10在细胞凋亡相关基因研究中的应用

10.3报告基因(GFP)的检测与分析

10.3.1报告基因转染效率和(或)GFP融合蛋白表达的检测与分析

10.3.2GFP融合基因的细胞周期检测与分析GFP／PI双标记法

10.3.3在细胞凋亡相关基因研究中的应用一GFP／Annexin-V／PI三色标记法

第11章其他流式细胞术应用技术

11.1胞内活性氧水平的检测与分析

11.1.1DCFH-DA单染色法

11.1.2DCFH／PI染色法

11.1.3双氢罗丹明(Rhodamine)123染色法

11.2细胞膜电位的检测与分析

11.2.1检测细胞膜电位的染料及其检测原理

11.2.2Cyanine(花青苷)染色法

11.2.3罗丹明123染色法

11.2.4JC-1染色法

11.3细胞内钙离子浓度的检测与分析

11.3.1检测细胞内钙离子浓度的荧光探针与检测原理

11.3.2细胞内钙离子浓度的检测与分析Fluo-3／AM染色法

11.4荧光共振能量转移技术及应用

11.5干细胞(SP)的检测Hoechst33342法

第12章流式细胞仪的发展和商品化仪器

12.1流式细胞仪的发展历史和趋势

12.1.1专业化的流式细胞仪纷纷面世

12.1.2仪器全面自动化

12.1.3多色多参数分析迅速发展

12.2流式细胞仪商品仪器概述

12.2.1激发光源及其荧光染料

12.2.2液流系统

12.2.3信号检测和光电转换

12.2.4分选系统

12.2.5数据处理与分析

12.2.6流式微球芯片

12.2.7图像流式细胞仪

12.3流式细胞仪的主要技术指标

12.3.1荧光分辨率

12.3.2荧光灵敏度

12.3.3前向角散射光灵敏度

12.3.4前向角散射光分辨率

12.3.5分析速度

12.3.6分选指标

附录1常见流式细胞术及荧光显微镜荧光染料激发波长与发射波长快查表

附录2

2.1常用溶液的配制

2.2Hanks液的配制

2.3磷酸盐缓冲液(PB)的配制

参考文献

　　本书按照细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、细胞遗传学、生物化学等学科的应用领域进行归类，全面而详尽地介绍流式细胞术的应用范围，涉及细胞表面分子、细胞内或细胞核内抗原、细胞凋亡、DNA含量与细胞周期、细胞增殖、细胞毒作用、可溶性蛋白质分子、报告基因等的检测和分析，并介绍了流式细胞术的其他用途。