三、综合应用

11.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒,pBR322质粒是较早构建的质粒载体,其主要结构如图1所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因,以便于　　　　　　　　　　　　　　。

(2)pBR322分子中有1个EcoRⅠ限制性内切酶作用位点,EcoRⅠ只能识别序列-GAATTC-,并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点,请画出目的基因两侧被限制性内切酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

(3)pBR322分子中另有1个BamHⅠ限制性内切酶作用位点,现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制性内切酶BglⅡ处理得到的目的基因,通过DNA连接酶作用恢复　　　　　　　　键,成功地获得了重组质粒。这说明　 　。

(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌,将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养,得到如图2的菌落。再将灭菌绒布放到培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布放到含四环素的培养基上培养,得到如图3的结果(空圈表示与图2对照无菌落的位置)。与图3空圈相对应的图2中的菌落表现型是　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　,图3结果显示,多数大肠杆菌导入的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(填"重组质粒"或"pBR322质粒")。

解析:(1)质粒上的抗性基因可作标记基因,便于鉴定受体细胞中是否导入目的基因。(2)在目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点,即目的基因两侧都有-GAATTC-。(3)DNA连接酶能连接磷酸二酯键。经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制性内切酶BglⅡ处理得到的目的基因能连接起来,说明这两种限制性内切酶切割得到的末端相同或互补。(4)图2中的菌落能抗氨苄青霉素,将灭菌绒布放到图2中培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布放到图3含四环素的培养基上培养,仍能生长的为抗四环素的菌落,空圈为不能抗四环素的菌落(只能抗氨苄青霉素)。图3结果显示,多数大肠杆菌既能抗氨苄青霉素,又能抗四环素,说明导入的是pBR322质粒,而不是重组质粒(重组质粒的四环素抗性基因被切断,不能表达,因此含重组质粒的大肠杆菌只抗氨苄青霉素)。

答案:(1)鉴别目的基因是否导入受体细胞

　　(2)

　　(3)磷酸二酯　两种限制性内切酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的末端相同(或互补)　(4)能抗氨苄青霉素,但不能抗四环素　pBR322质粒

12.限制性内切酶 Ⅰ 的识别序列和切点是-G↓GATCC-,限制性内切酶 Ⅱ 的识别序列和切点是-T↓GATC-。在质粒上有酶 Ⅰ 的一个切点,在目的基因的两侧各有1个酶 Ⅱ 的切点。用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA。

(1)请画出质粒被限制性内切酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。

(2)请画出目的基因两侧被限制性内切酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。