课题3 血红蛋白的提取和分离

一、学习目标：

　　本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

二、重点：

　　凝胶色谱法的原理和方法

三、难点：

　　样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【基础梳理】

一、凝胶色谱法

　1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。

2、原理

（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。

（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使

不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。

　2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

三、电泳

　1、概念：指 在电厂的作用下发生 的过程。

　2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上

　 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、

的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。

4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。

四、实验操作

1、样品处理:通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。

(1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。

(2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

　　(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去

　　 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。

2、粗分离：即透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。

(2)目的：将 的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

(1)凝胶色谱柱的制作。

(2)凝胶色谱柱的装填

①材料：本实验使用的是 。