②方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在；不能发生 流干露出凝胶颗粒的现象。

(3)样品的加入和洗脱

①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。

b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。

c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。

②洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。

4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。五、操作提示

1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。

　　2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的

　　 用 加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。

4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。

【探究归纳】

一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?

二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?

三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?

四、凝胶色谱法的原理归纳

【典例导析】

类型一 凝胶色谱法分离蛋白质

　　【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是

　　 。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由

替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。

（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填"相同"或"不同")，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。

【思路点拨】用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白