所用的DNA聚合酶（即Taq酶）是从嗜热性细菌体内提取并分离的，具有耐高温性；DNA分子结构中G-C碱基对（之间形成了三个氢键）比A-T碱基对（之间形成两个氢键）稳定，因此G-C碱基对含量高的序列耐高温；DNA连接酶的作用是缝合限制酶切割的粘性末端，恢复磷酸二酯键，对所连接的DNA碱基序列没有专一性要求。基因工程中如果受体细胞是植物，转化时常用农杆菌转化法。在得到重组质粒T时，目的基因和质粒都用到了EcoRl，在重组质粒中又会形成新的EcoRl酶切位点，EcoRl和Smal 酶切割质粒时保留了Pstl的切割位点，所以用EcoRl和Pstl切割时可以得到两种DNA分子。而重组质粒中已经失去了Smal酶的识别序列，只能得到一种DNA分子片段。

【答案】⑴耐高温 ⑵引物对B ⑶否 ⑷农杆菌 ⑸① 2 ② 1

【例3】目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，图为pBR322质粒载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

(1) pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR 1只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端 ______________ 。

（2）将含有目的基因的DNA与pBR322质粒载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。

(3) pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复______ 键，成功的获得了重组质粒。说明________ 。

(4) 为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是________ ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_____。

（5）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。

（6）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时是 。

【精析】（2）DNA连接酶在连接黏性末端时，只要黏性末端能互补配对，是不区分质粒还是目的基因的，所以可产生目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物。要想得到分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化；

（3）现用两种不同的酶切割也能得到重组质粒，说明两种酶切割形成的黏性末端是相同的。

（4）pBR322质粒中的两个抗性基因，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上，含青霉素的培养基中，酶切位点没有破坏青霉素抗性基因ampR，只要含有目的基因-载体连接物、载体-载体连接物都可以生存；在含四环