可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。

　　(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养。在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

　　(3)细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

　　四、灭菌操作

　　1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 ℃、15 min)处理，并在超净台上使用。

　　注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。

　　2．各种培养基必须是无菌的。

　　3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。

　　注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

　　五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤

　　1．在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。

　　2．灭菌后待培养基冷却至60 ℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。

　　3．扩大培养

　　先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 ℃每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。

　　4．划线分离

　　用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到在摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

　　5．在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。

　　1．如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？

提示：(1)胆大心细，操作快捷；(2)注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率